玉米慢消化淀粉的酶法制備及性質研究

  • 時間: 2014-07-29 15:01:50
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王琳 高群玉

  (華南理工大學輕工與食品學院,廣州市 510640)

  摘要 以普通玉米淀粉為原料,利用β-淀粉酶和葡萄糖苷轉移酶協同處理制備慢消化淀粉,并研究其理化性質。試驗表明,原淀粉在β-淀粉酶加酶量為20mL、反應時間為4h,葡萄糖苷轉移酶加酶量為20mL、反應時間為12h時,慢消化淀粉含量最高可達16.37%;經過雙酶處理后的樣品的淀粉-碘吸附結合物的最大吸收峰位置,隨著慢消化淀粉含量的增加而偏移增大;與玉米原淀粉A型結晶結構相比,所有樣品的晶型消失;掃描電鏡結果顯示,酶解后的樣品變成不規則碎片。

  關鍵詞 玉米淀粉;慢消化淀粉;大麥β-淀粉酶;葡萄糖苷轉移酶

  ABSTRACT The common corn starch was applied as raw material to prepare the slowly digestible starch through the use of β-amylase and transglucosidase. The physicochemical properties were also investigated. The results indicated that the content of SDS was up to 16.37% with addition of 20mL β-amylase and 20mL transglucosidase by stirring for 4h and 12h, respectively. The position of maximum absorption peak of starch samples binding iodine shifted obviously with increasing the slowly digestible starch content. Compared to the native corn starch displayed “A” typical diffraction pattern, crystal structure of all samples modified by enzymes disappeared. Scanning electron micrographs revealed that all enzyme-treated samples had more irregular shapes.

  KEY WORDS corn starch; slowly digestible starch; β-amylase; transglucosidase

  淀粉是植物中碳水化合物貯藏的主要形式,也是為人體提供能量的主要來源。由于淀粉消化的方式和速度會影響人體餐后的血糖應答,故英國學者Englyst等[1]根據葡萄糖的釋放率和其在胃腸道的吸收,將淀粉分為易消化淀粉(ready digestible starch, RDS)、緩慢消化淀粉(slowly digestible starch, SDS)和抗性淀粉(resistant starch, RS)三類。其中,易消化淀粉指的是在攝入后引起血糖快速增加的淀粉(0 20min);緩慢消化淀粉指的是在小腸中被完全消化,但速率較慢的淀粉(20 120min);抗性淀粉指的是在小腸中不被消化,卻可在大腸中被微生物發酵利用的淀粉(>120min)[2]。緩慢消化淀粉具有多種生理功能,可以調節機體血糖水平,降低餐后胰島素分泌;有利于控制肥胖、保持適宜體重,可作為肥胖人群的減肥產品;還可改善腸道運動,減少腸機能失調及結腸癌等發病率[3]。

  緩慢消化淀粉的制備主要依賴于淀粉酶的作用。β-淀粉酶作為外切酶,不能水解α-1,6葡萄糖苷鍵也不能越過分支點繼續水解,但可以從淀粉的非還原端依次切開α-1,4糖苷鍵,得到麥芽糖單位[4],促使淀粉鏈長縮短。而葡萄糖苷轉移酶可以催化低聚麥芽糖的水解和它的轉移反應,形成新的α-1,6葡萄糖苷鍵,同時生成具有多分支結構的糖苷鍵[5]。于國萍等[6]在2011年分別利用α-淀粉酶和β-淀粉酶處理普通玉米淀粉制備緩慢消化淀粉,發現兩種制備方法的最佳工藝條件差別不大,但β-淀粉酶法制備的SDS產品得率要優于α-淀粉酶,并指出β-淀粉酶更適宜提高SDS產率。Zihua Ao等[7]在2007年通過采用麥芽糖α-淀粉酶、β-淀粉酶以及這兩種酶分別添加葡萄糖苷轉移酶四種方法水解玉米淀粉,增加淀粉的分支結構,降低淀粉的消化率,研究表明β-淀粉酶與葡萄糖苷轉移酶協同可制備較高含量的SDS產品。目前,國外學者對SDS的研究非常活躍,在國際上已成為新的研究熱點。但國內學者對酶法制備SDS多為單一改性,對雙酶制備SDS及其詳細的理化性質分析并沒有深入闡述。

  本實驗采用β-淀粉酶與葡萄糖苷轉移酶雙酶協同制備玉米緩慢消化淀粉,探究β-淀粉酶、葡萄糖苷轉移酶不同加酶量對緩慢消化淀粉形成過程的影響,并重點闡述了不同SDS含量樣品的淀粉-碘吸附結合物的吸收曲線、X射線衍射圖、熱力學性質和顆粒形貌,以期更好地闡明雙酶處理對SDS結構和緩慢消化性質的影響,為制備高含量的SDS提供理論依據。

  1 材料與方法

  1.1 實驗材料和設備

  普通玉米淀粉,中糧生化能源(公主嶺)有限公司;大麥β-淀粉酶(65u/mL)、葡萄糖苷轉移酶L-AMANO(3ku/mL),阿瑪諾天野酶制劑商貿(上海)有限公司;豬胰酶(P7545)、淀粉葡萄糖苷酶(A7095),美國Sigma公司;GOPOD葡萄糖試劑盒,愛爾蘭Megazyme公司;實驗中所使用的其它試劑或藥品均為分析純。

  EVO 18掃描電子顯微鏡,德國Zeiss公司;DSC-8000差示掃描量熱儀,美國Perkin Elmer公司;D8 Advance X射線衍射儀,德國Bruker公司;i5紫外可見分光光度計,濟南海能儀器有限公司;XW-80A漩渦混合器,上海精科實業有限公司產品;HH-2數顯恒溫水浴鍋,江蘇金壇市富華儀器有限公司;恒溫振蕩器,常州澳華儀器有限公司。

  1.2 慢消化淀粉樣品制備

  1.2.1 β-淀粉酶添加量對慢消化淀粉含量的影響

  稱取8g(干基)玉米淀粉,用pH5.2的0.5mol /L乙酸-乙酸鈉緩沖溶液配成8%的淀粉乳,于95℃水浴下充分攪拌30min,糊化完全后冷卻至55℃,分別加入10、15、20、25、30mL β-淀粉酶,并添加緩沖液使溶液總體積均為130mL,反應4h后沸水浴滅酶10min。冷卻至室溫,在已滅酶的反應液中加入20mL葡萄糖苷轉移酶繼續反應,置于55℃恒溫水浴中攪拌12h。反應結束后,加入等體積的無水乙醇,于4000r/min離心15min,重復2次。將所得沉淀物在45℃烘箱中烘24h,粉碎、過100目篩,即得不同β-淀粉酶添加量所制得的SDS樣品B10、B15、B20、B25、B30。

  1.2.2 葡萄糖苷轉移酶添加量對慢消化淀粉含量的影響

  將8%的玉米淀粉乳糊化并冷卻至55℃,添加20mL β-淀粉酶與10mL緩沖液反應4h,沸水浴10min滅酶,冷卻至室溫,分別添加10、15、20、25、30mL葡萄糖苷轉移酶,并加入一定量的緩沖液使溶液總體積保持一致,置于55℃恒溫水浴中攪拌12h。其它處理條件同1.2.1,得到不同葡萄糖苷轉移酶添加量所制得的SDS樣品,分別記為T10、T15、T20、T25、T30。

  1.3 慢消化淀粉含量測定方法[1、8]

  制備混酶:稱取1.5g豬胰酶于50mL離心管中,加入5mL 0.1mol/L的乙酸鈉緩沖液和磁力攪拌棒,在漩渦混合器上渦旋混勻后,置于磁力攪拌器攪拌10min,然后以4000r/min離心10min。在上清液中加入0.5mL淀粉葡萄糖苷酶,即為混酶。

  稱取0.3g(干基)淀粉樣品于COD管中,添加7.5mL pH 5.2的0.1mol /L乙酸鈉緩沖液,渦旋混勻5min,并置于95℃水浴中均勻糊化30min。反應結束后立即放入37℃水浴中,待溫度平衡后加入5粒玻璃珠,水平放入恒溫振蕩器,加入0.75mL混酶,開始振蕩反應(160r/min)并準確計時。在20min、120min分別從COD管中取出0.5mL水解液于裝有20mL 66%乙醇的離心管中滅酶,渦旋混勻,并于4000r/min離心10min。離心后的上清液用GOPOD法在510nm處測定葡萄糖含量。淀粉各營養片段的計算公式如下:

  其中:G20為淀粉酶水解20 min 后產生的葡萄糖含量,mg;FG為酶水解處理前淀粉中游離葡萄糖含量,mg;G120為淀粉酶水解120 min后產生的葡萄糖含量,mg;TS為總淀粉含量,mg。

  1.4 淀粉樣品的碘吸附及波長掃描[8]

  稱取2.0g碘化鉀,加適量蒸餾水形成飽和溶液,加入0.2g碘,待碘全部溶解后將溶液定量轉移至100mL容量瓶中,加水至刻度、搖勻,低溫避光保存。

  稱取0.08g淀粉樣品于20mL二甲基亞砜中,加熱溶解后取1mL樣品溶液轉移至100mL蒸餾水中,混勻、靜置。取出3mL,并加入75uL碘試劑,搖勻后立即倒入比色皿中。掃描范圍為500 750nm,掃描間隔為1nm,掃描速度為慢速,得到淀粉-碘吸附結合物的吸收曲線。

  1.5 X射線衍射

  將玉米慢消化淀粉樣品置于相對濕度為100%的干燥器中平衡12h,以消除水分對其結晶度的影響。取一定量已平衡好的樣品置于X射線衍射儀進行測定。測試條件為:起始角7°、終止角35°、掃描步長0.04°、掃描速度5°/min、入射線波長0.15nm、靶型Cu、濾波片Ni、管壓40KV、管流40mA。

  1.6 淀粉顆粒熱力學性質

  采用差示掃描量熱儀測定淀粉的熱性質。準確稱取3mg淀粉樣品于樣品盤中,加入適量的蒸餾水配成質量濃度為30%的淀粉乳溶液,立即將樣品盤壓緊密封,室溫下平衡4h。以空白樣品盤做參比,10℃ /min 速率升溫,在30℃保溫1 min,從30℃升溫到150℃,用Pyris軟件分別計算出樣品的To(起始溫度)、Tp(峰值溫度)、Tc(終止溫度)及ΔH(糊化焓)等。

  1.7 淀粉的顆粒形貌分析

  將待測淀粉樣品置于105℃的烘箱中干燥4h,用導電雙面膠將其固定在樣品臺上,噴金處理后,置于掃描電鏡中觀測并拍攝淀粉顆粒形貌。

  1.8 數據分析處理

  各組實驗數據均為3次重復測定之后的平均值,并用Origin 8.0作圖。

  2 結果與分析

  2.1 β-淀粉酶添加量對慢消化淀粉含量的影響

  β-淀粉酶只能從分子鏈尾端開始水解,可切斷α-1,4糖苷鍵,得到麥芽糖單位,使得淀粉鏈長被縮減,短淀粉鏈的分子增多,在葡萄糖苷轉移酶的作用過程中容易形成慢消化淀粉。β-淀粉酶添加量對慢消化淀粉含量的影響如表1所示。

  表1 不同β-淀粉酶添加量對慢消化淀粉含量的影響

樣品

RDS含量(%

SDS含量(%

RS含量(%

B10

80.30

4.12

15.58

B15

79.79

4.83

15.38

B20

70.99

16.37

12.64

B25

76.22

13.74

10.04

B30

82.66

7.36

9.98

  由表1可以看出,當β-淀粉酶添加量小于20mL時,SDS含量隨著加酶量的增加而增加,當SDS含量達到最高值16.37%時,繼續加大β-淀粉酶的用量,SDS含量反而下降。這是由于經過β-淀粉酶處理的淀粉,直鏈淀粉和支鏈淀粉外鏈的長度被縮短,形成密集的分支鏈,從而改變了淀粉的慢消化功能[9]。淀粉的分支程度不同,SDS含量變化明顯。β-淀粉酶添加量直接影響淀粉的平均鏈長,添加量較低會使得淀粉不能被有效的水解成短鏈分子,不利于葡萄糖苷轉移酶的轉移;添加量過高,淀粉分子充分水解,產生大量過短的淀粉鏈,會起到抑制作用,不易于淀粉鏈的進一步靠近,從而不利于SDS的形成。只有適量β-淀粉酶的添加,可以更好的形成特定的淀粉分支結構,從而減緩淀粉的消化速率,得到較高含量的SDS。同時,隨著β-淀粉酶添加量的增多,RDS含量呈現先降低后增加的趨勢,且在β-淀粉酶添加量為20mL時有最小值;而所有樣品的RS含量則不斷降低。Zhang等[10]研究表明SDS與RS在結構上比較相像,而與RDS則有著本質上的區別,因此,降低RDS的含量也可達到制備高含量慢消化淀粉的目的。

  2.2 葡萄糖苷轉移酶添加量對慢消化淀粉含量的影響

  葡萄糖苷轉移酶提高SDS含量的原理是葡萄糖苷轉移酶可催化低聚麥芽糖的水解并促進其發生轉移,得到更多側鏈的多分支結構的糖苷鍵,淀粉的分支密度增加,從而減緩淀粉的消化速率[11]。

  表2 不同葡萄糖苷轉移酶添加量對慢消化淀粉含量的影響

樣品

RDS含量(%

SDS含量(%

RS含量(%

T10

78.27

6.70

15.03

T15

75.43

9.90

14.67

T20

70.99

16.37

12.64

T25

73.84

8.25

17.91

T30

74.57

7.24

18.19

  如表2所示,葡萄糖苷轉移酶加酶量由10mL增加至20mL時,SDS含量逐漸升高,在加酶量為20mL時達到最高值16.37%,但是當葡萄糖苷轉移酶添加量達到一定限度時,加酶量增加反而會抑制SDS的形成,呈現下降趨勢,這與β-淀粉酶添加量一樣。這是由于葡萄糖苷轉移酶加酶量較低,無法促使經β-淀粉酶作用后的短淀粉鏈的分支充分轉移,淀粉的分支密度較低,淀粉的消化性能不能被有效改善;當葡萄糖苷轉移酶加酶量較高時,可能由于分支密度過高,反而不利于形成有序牢固的多分支結構。由此可見,只有特定程度的加酶量,才能獲得較高含量的SDS。同時,隨著葡萄糖苷轉移酶加酶量的增加,RDS和RS含量都是先降低后升高,并且在20mL處分別有最小值70.99%和12.64%。由此可見,葡萄糖苷轉移酶加酶量的不同也會影響RDS和RS的含量的變化,這與Ao等[7]的研究結果基本一致。

  2.3 淀粉樣品的碘吸附

  圖1 淀粉-碘吸附結合物吸收曲線

  淀粉分子具有螺旋狀的卷曲,當碘分子與淀粉相接觸時,碘分子可借助范德華力進入淀粉分子的螺旋中心,使得直鏈淀粉束縛大量的碘分子,形成了淀粉-碘復合物,在可見光范圍內呈現最大的光吸收,因而呈藍色[12],且淀粉的平均鏈長越短,淀粉在最大吸收處的波長越小。

  從圖1可以看出,玉米原淀粉的吸光度值要遠遠高于經過雙酶處理后樣品的吸光度值,且在598nm處出現最大吸收峰。而其它樣品的吸光度值和最大吸收峰均有所偏移,但變化趨勢基本保持一致。T10、T15、T20、T25、T30吸光度值逐漸上升,這與葡萄糖苷轉移酶加酶量呈現線性關系,可能是由于淀粉分支密度的改變,影響了碘分子與淀粉的吸附能力[13],致使光吸收略有加強。與原淀粉相比,所有樣品的最大吸收峰的位置都向短波長方向進行了偏移,均出現在572 585nm之間,且相對偏移程度為從T10到T20逐漸增大,T20到T30逐漸減小,其中T20偏移最大,最大吸收峰處的波長僅為572nm,可見偏移程度越大,慢消化淀粉含量越高。熊珊珊等[8]研究葡萄糖苷轉移酶的處理時間長短對淀粉-碘吸附能力的影響時,也指出吸收峰的偏移程度與SDS含量的變化一致。

  2.4 X射線衍射

  圖2 玉米原淀粉及樣品的X射線衍射圖

  由圖2可知,玉米原淀粉屬于典型的A型結晶結構,其在X射線衍射圖譜上的15.1°、17.1°、18.0°、22.9°處出現較強的衍射峰。糊化處理后的淀粉在圖譜上不出現衍射峰,這表明淀粉經過糊化處理后,屬于無定型態結構。而經過雙酶處理后的所有淀粉樣品,不屬于任一典型的結晶結構,僅在2q=19.8°附近出現尖銳的衍射峰,在2q=13.1°附近有一彌散峰。Casarrubias等[14]用β-淀粉酶和葡萄糖苷轉移酶共同處理芒果淀粉的研究也表明,淀粉經過雙酶處理后晶型消失。

  2.5 淀粉顆粒熱力學性質

  表3 不同樣品的熱力學性質參數

樣品

起始溫度

To/

峰值溫度

TP/

終止溫度

TC/

起始與終止溫度差

TC-To/

糊化焓

ΔH/(J·g-1)

原淀粉

71.49

77.45

84.61

13.12

11.02

糊化淀粉

0

0

0

0

0

T10

104.70

120.88

128.74

24.04

2.81

T15

108.65

124.58

131.02

22.37

7.82

T20

110.87

125.72

132.59

21.72

8.08

T25

107.57

124.34

130.19

22.62

5.81

T30

106.91

121.78

129.65

22.74

4.49

  從表3可以看出,與原淀粉相比,糊化處理后的淀粉沒有出現吸收峰,說明淀粉經過完全糊化后,不發生相轉變現象。而所有慢消化淀粉樣品的糊化起始溫度To、峰值溫度Tp、終止溫度Tc、起始與終止溫度差Tc-To均有顯著的提高,由此可見,經過雙酶處理后的樣品,淀粉的內部結構發生改變,鏈長和分支密度的改變在影響SDS含量的同時,多分支結構的增加也會使得淀粉的糊化愈加困難,說明SDS含量越高的樣品越難糊化。Tc-To的變化反映淀粉顆粒內部結構的差異程度,Tc-To越大表明差異程度越大[15],隨著SDS含量的增加,Tc-To逐漸減小,這是因為淀粉內部分支結構趨向于緊密有序的方式排列、完善程度差異變小的緣故。糊化焓(DH)指的是在給定溫度下體系趨向于達到自由能最小的狀態時,伴隨著結構變化所發生的熱焓的改變。Cooke等[16]認為DH主要反映的是雙螺旋結構的破壞,而不是結晶體的破壞。繆銘[17]也指出經過酶解得到的SDS是由一小部分支鏈淀粉短鏈構成的雙螺旋有序結構和大部分無定型區構成的。經過酶解的樣品結晶體被破壞,可能存在部分雙螺旋結構,因此所有樣品的焓值比原淀粉小。樣品T20在所有樣品中有最高的峰值溫度(125.72℃)和糊化焓(8.08J·g-1),表明SDS含量越高的樣品,其雙螺旋結構越穩定,熱穩定性越好。

  2.6 淀粉顆粒形貌變化

  (A)玉米原淀粉(´1000) (B)T10(´500)

  (C)T15(´500) (D)T20(´500)

  (E)T25(´500) (F)T30(´500)

  圖3 玉米原淀粉及酶解淀粉樣品的掃描電鏡照片

  利用掃描電子顯微鏡對淀粉樣品的形貌進行研究分析,考察玉米淀粉在酶解前后淀粉顆粒的表面微觀結構的變化情況,結果如圖3所示。玉米淀粉經過糊化和雙酶處理后,顆粒大小和形狀都發生了顯著變化。玉米原淀粉顆粒的大小為5 20μm,多為實心圓或多角形,表面結構緊密,棱角光滑。與原淀粉形貌完全不同,經過糊化、雙酶處理后的SDS淀粉樣品,不再具有原淀粉的顆粒結構,均呈現出不規則的碎片狀,碎片大小約為20 50μm。這可能是淀粉在高溫糊化時,顆粒結構被破壞。

  3 結論

  本實驗研究了雙酶協同作用制備慢消化淀粉,當β-淀粉酶加酶量為20mL、反應時間4h,再經過葡萄糖苷轉移酶加酶量為20mL、反應時間12h,可使SDS含量從3.79%提高到16.37%。經過雙酶處理后的樣品,隨著慢消化淀粉含量增加,淀粉-碘吸附結合物的最大吸收峰位置的偏移逐漸增大;熱穩定性增強,淀粉糊化變得困難;與玉米原淀粉A型結晶結構相比,經過雙酶處理的樣品晶型消失,僅在2q=19.8°附近出現尖銳的衍射峰,在2q=13.1°附近有一彌散峰;掃描電鏡結果顯示酶解后的樣品變成不規則碎片,顆粒結構破壞。試驗證明,β-淀粉酶和葡萄糖苷轉移酶協同處理普通玉米淀粉,可以有效的提高慢消化淀粉的含量,改善淀粉的消化性能,為制備玉米慢消化淀粉的深入研究提供實驗條件和理論基礎。

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